При подозрении на инфекцию в стационаре лаборатории важно как можно раньше дать врачу информацию о возможном возбудителе. Однако получение и идентификация бактериальной культуры требуют времени. Как сократить ожидание и сохранить информативность исследования?

Эта задача стала отправной точкой для создания HOSPITAL-TEST — совместной разработки компании «ТестГен» и Самарского государственного медицинского университета. Директор по науке «ТестГен» Алексей Вячеславович Соловьёв и специалисты СамГМУ рассказали, как формировалась диагностическая панель, какие сложности возникали при разработке и как проверяли работу тест-системы.

От задачи лаборатории к выбору технологии

Диагностика инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), требует взаимодействия клиницистов, лаборатории и специалистов по эпидемиологической безопасности. Информация о выявленных микроорганизмах помогает уточнить возможную причину инфекционного процесса и определить дальнейшие диагностические действия.

Для решения этой задачи разработчики выбрали мультиплексную полимеразную цепную реакцию в реальном времени — ПЦР-РВ. Технология позволяет выявлять несколько генетических мишеней в одной реакционной пробирке. Лаборатория получает возможность одновременно исследовать образец на несколько микроорганизмов, включённых в панель.

Молекулярному исследованию не требуется предварительное выращивание бактерий: оно направлено на обнаружение определённых участков их ДНК. Это позволяет сократить время получения информации о возможном возбудителе по сравнению с исследованием, включающим посев и выращивание культуры.

Как формировалась панель

Перечень мишеней должен соответствовать реальным задачам лаборатории. По словам А. В. Соловьёва, при разработке HOSPITAL-TEST учитывали данные о распространённости возбудителей, в том числе представленные в российской системе мониторинга антибиотикорезистентности AMRmap.

Один из вариантов комплектации — HOSPITAL-TEST-KPA в жидком формате. Набор предназначен для качественного определения ДНК микроорганизмов методом ПЦР-РВ. В его панель включены мишени для выявления таких бактерий, как Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii. Модель HOSPITAL-TEST-LAC выявляет метициллин-резистентные Staphylococcus spp, (гены mecA и mecC), а также ген токсина лейкоцидина Пантона Валентайна, фактор патогенности Staphylococcus aureus lukS, а модель HOSPITAL-TEST-ESE направлена на обнаружение Staphylococcus spp. (ген mecA), Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium.

При формировании панели важно выбрать не только микроорганизмы, но и генетические участки, по которым тест-система будет их распознавать. Следующая задача — обеспечить согласованную работу всех компонентов реакции.

Что было самым сложным в разработке

«Самым сложным было обеспечить одновременное выполнение жёстких требований к аналитическим характеристикам набора — высокой чувствительности и специфичности — в формате мультиплексной ПЦР-РВ», — отмечает младший научный сотрудник лаборатории генетических технологий в микробиологии Научно-образовательного профессионального центра генетических и лабораторных технологий (НОПЦ ГЛТ) СамГМУ Даниил Кокорев.

В мультиплексной реакции одновременно работают несколько наборов праймеров и зондов — компонентов, обеспечивающих распознавание и выявление целевых участков ДНК. Их необходимо подобрать так, чтобы они не мешали друг другу и позволяли обнаруживать заявленные мишени, в том числе при низком содержании ДНК в образце.

Поэтому разработка включала проверку как отдельных компонентов, так и системы в целом. Расчётные решения последовательно оценивали экспериментально, а затем проверяли работу набора на клиническом материале.

Как объединили компетенции ТестГен и СамГМУ

Специалисты «ТестГен» обеспечивали общую координацию проекта, выполняли компьютерное проектирование тест-системы, разрабатывали программу экспериментальных работ и анализировали полученные результаты.

«Специалисты СамГМУ обеспечивали проведение экспериментальных и валидационных работ по проекту», — поясняет А. В. Соловьёв.

Команда Научно-образовательного профессионального центра генетических и лабораторных технологий СамГМУ участвовала в создании прототипа, проверке его характеристик и апробации на клиническом материале. Врачи клинико-диагностической лаборатории Клиник СамГМУ обеспечивали проведение клинических испытаний.

Совместная работа связала проектирование тест-системы с оценкой её работы в условиях медицинской лаборатории.

Как проверяли результаты

При исследовании разработанного набора использовали несколько методов сравнения. Результаты сопоставляли с другими ПЦР-тест-системами и культуральными исследованиями с последующей идентификацией микроорганизмов методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. А. В. Соловьёв также указывает на применение секвенирования по Сэнгеру.

Эти методы дают информацию разного характера. ПЦР выявляет целевые участки ДНК, культуральное исследование позволяет получить растущий микроорганизм, а MALDI-TOF помогает идентифицировать выделенную культуру.

Расхождения между результатами требуют отдельного разбора. Например, обнаружение ДНК при отрицательном посеве само по себе не доказывает активную инфекцию или превосходство одного метода. При интерпретации учитывают вид материала, предшествующую антибактериальную терапию и клиническую картину. В зависимости от микроорганизма и места взятия образца положительный результат может быть связан и с колонизацией — присутствием бактерий без развития инфекционного процесса.

Как связаны выявление возбудителя и оценка устойчивости

При обсуждении возможностей панели важно разграничивать идентификацию микроорганизмов и выявление конкретных механизмов антибиотикорезистентности.

Обнаружение бактерии, среди представителей которой встречаются продуценты карбапенемаз, не означает выявления самого механизма устойчивости. Аналогично исследование отдельных генетических маркеров не даёт полной картины чувствительности ко всем антибактериальным препаратам.

Поэтому молекулярные и культуральные исследования дополняют друг друга: ПЦР позволяет раньше получить информацию о заявленных мишенях, а выделение культуры и последующее определение антибиотикочувствительности помогают оценить действие препаратов на конкретный микроорганизм.

Что дальше

Разработчики связывают дальнейшее развитие с внедрением молекулярных исследований в повседневную работу медицинских лабораторий и адаптацией диагностических панелей к изменению структуры возбудителей.

«Будем оптимизировать комплектации набора под изменения распространенности нозокомиальных патогенов», — отмечает биолог лаборатории генетических технологий в микробиологии НОПЦ ГЛТ СамГМУ Арина Сизова.

А. В. Соловьёв также рассматривает высокопроизводительное секвенирование как перспективное направление, позволяющее одновременно исследовать множество генетических мишеней. Речь идёт о дальнейшем развитии молекулярной диагностики; действующий HOSPITAL-TEST основан на ПЦР-РВ.

Для лаборатории ценность такого подхода — в возможности раньше получить информацию о микроорганизмах, включённых в панель. В сочетании с клиническими данными и другими исследованиями она помогает уточнять диагностический поиск и поддерживает взаимодействие лаборатории с лечащим врачом.