Наборы ФЛЭШ для генотипирования

Предназначены для генотипирования выборок при количестве образцов от 10 до 1000-2000.

Для определения наличия определенных нуклеотидных последовательностей с помощью флуоресцентной детекции «в реальном времени» существует несколько методов, наиболее известными из которых являются методы с интеркалирующим красителем SYBR Green I, методы со специфичными зондами на основе разрушаемых олигонуклеотидных проб (TaqMan) и шпилечных структур (Scorpions). Выбор метода детекции является крайне важным для тест-системы, так как каждый из методов обладает своими достоинствами и недостатками, областью применения и характеристиками.

В наших наборах мы используем широко распространенный метод детекции с использованием явления переноса энергии с помощью флуоресцентного резонанса (FRET). Вариант технологии TaqMan на основе разрушаемых олигонуклеотидных зондов с химическими модификациями LNA (locked nucleic acids) позволяет добиться высоких показателей чувствительности и специфичности тест-системы и преодолеть такие недостатки других подходов как низкая специфичность и частые ложноположительные результаты, а также неудобство работы, связанное с необходимостью проводить тест в двух раздельных пробирках для интеркалирующего красителя SYBR Green I. Предлагаемый метод TaqMan-LNA универсален и может быть применен для любых полиморфных маркеров или мутаций.

Нами разработаны и опробованы в лабораториях РФ и СНГ наборы для более чем 300 полиморфных маркеров генома человека. Наборы совместимы со всеми распространенными Real-Time амплификаторами: ABI 7300/7500/StepOne, Bio-Rad iQ5/CFX, Rotor-Gene 3000/6000, ДТ-96 и др.

Состав набора

Наборы рассчитаны на 200-2000 определений для одного локуса и включают все реагенты, достаточные для генотипирования паспортного количества образцов ДНК в 10 мкл реакционной смеси по одному локусу (SNP). В зависимости от модели амплификатора объем реакционной смеси можно варьировать (от 5 до 20 мкл).

Принцип действия

В реакционную смесь введены два ДНК-зонда (к двум аллелям исследуемого полиморфизма), каждый из которых содержит флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. В исходном растворе фоновая флуоресценция минимальна, но в результате проведения амплификации флуоресцентные красители высвобождаются, что позволяет детектировать наличие в амплифицированной смеси того или иного аллеля образца ДНК. Специальные условия амплификации и дизайн зондов позволяют добиться раздельного высокоспецифичного определения двух аллелей в одной реакционной пробирке.

TaqMan анализ основан на 5`-нуклеазной активности Taq-полимеразы, которая отщепляет нуклеотиды от олигонуклеотидных зондов, гибризованных с ДНК. Необходимо два TaqMan зонда с разными полиморфными сайтами. Один зонд должен быть комплементарен дикому аллелю, другой – полиморфному варианту. Эти зонды имеют разные флуоресцентные красители на 5`-конце и гасители флуоресценции на 3`-конце. Когда зонды неактивны, то гасители взаимодействуют с красителем с помощью механизма FRET, блокируя флуоресцентную активность. На этапе отжига праймеров в процессе ПЦР TaqMan зонды гибридизуются с молекулой ДНК. На этапе расплетения 5`-конец красителя отщепляется, благодаря 5`-нуклеазной активностиTaq-полимеразы, что приводит к увеличению уровня флуоресценции красителя. Ошибочное спаривание оснований в зондах приводит к отщеплению целого зонда без высвобождения красителя. Генотип образца определяется отношением интенсивностей свечения двух разных красителей.