В настоящее время всё большее внимание уделяется генотипированию однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в судебной медицине. Причём подобное типирование используется не только для Y–хромосомы или митохондриальной ДНК, но и для аутосомальных SNP. Интерес судебных экспертов к аутосомальным SNP вызван рядом потенциальных преимуществ, таких как низкий уровень мутационных изменений и облегчение анализа деградированных образцов с помощью коротких ампликонов. Постоянно разрабатываются новые методы генотипирования SNP, реактивы для генотипирования, а также новые платформы. Поэтому трудно выделить лучшую технологию из доступных на сегодняшний день. Эта статья предлагает читателю обзор разных технологий с их плюсами и минусами для различных нужд как судебной практики так и медицинской диагностики.

1. Введение

В настоящее время всё ещё трудно оценить истинное число SNP в геноме человека, но в различных частных и популярных изданиях говорится о более чем пяти миллионах однонуклеотидных полиморфизмов, обнаруженных у человека, и около четырёх миллионах, которые были официально признаны полиморфными маркёрами для одной или нескольких обширных популяционных групп. Их количество, а также их относительная простота идентификации и ограниченное число аллелей – вот основная причина проявляемого со стороны медицинской генетики интереса. Сейчас они могут быть использованы как полиморфные маркёры для идентификации тех генов, которые являются предрасполагающими к определённым болезням, и могут помочь расширить потенциал фармакогенетики при анализе различного ответа на воздействие медицинских препаратов. Картирование генома человека сделало возможным создать карту гаплотипов человека, чтобы лучше исследовать вариабельность SNP. Карта гаплотипов или "HapMap" (http://www.hapmap.org) станет инструментом, который позволит исследователям находить гены и полиморфизмы, которые влияют на здоровье и могут приводить к болезням. Проект «HapMap» представляет большую ценность, т. к. уменьшает число SNP, необходимых при исследовании ассоциации в полноразмерном геноме. В судебной практике интерес к SNP постоянно растёт. Причина такого внимания заключена в том, что они имеют ряд характеристик, которые очень важны для судебной медицины. Во-первых, они имеют очень маленький процент мутаций, и это играет существенную роль при установлении отцовства. Во-вторых, они очень подходят для анализа с использованием высокопроизводительных технологий, а это существенно для формирования баз данных и автоматизации процесса. Кроме того, SNP поддаются анализу в коротких ампликонах. Это представляет интерес, т. к. следует учитывать, что размер продукта амплификации влияет на точность анализа при определении результатов в деградировавших образцах. Предварительные материалы по идентификации жертв теракта 11 сентября 2001 года во Всемирном торгом центре наглядно показывают потенциал данного типа маркёров, так как стандартные методики, основанные на использовании CODIS-панели (STR- и VNTR-маркеры) не позволили провести идентификацию останков, подвергшихся сильному воздействию разрушающих факторов. SNP имеют некоторые ограничения. Во-первых, количество SNP требует в среднем четырёхкратного превышения количества STR, таким образом, для аналогичного исследования в судебной медицине с помощью мультиплексной ПЦР требуется 60 хорошо сбалансированных SNP. Во-вторых, реальная стоимость такой революционной технологии пока неизвестна, хотя предполагается, что для высокотехнологичного производства она составит не более 0.01 евро за один полиморфизм, что гораздо ниже, чем при использовании даже наборов при использовании технологии STR. В любом случае, определение отцовства является несложной процедурой и вполне эффективно при использовании метода STR. Наконец, опыт применения метода STR огромен и накапливался в течение последних 15 лет. К примеру, мутации и полиморфизмы фланкирующих областей для STR известны, в то время как для SNPs выявление оных может стать проблемой, так как для детального исследования популяционных групп требуется огромное число маркеров. В настоящее время сложно сказать станет ли метод SNP лидирующим в судебной практике и заменит ли он существующий метод STR, но уже сейчас можно с уверенностью сказать, что метод SNP успешно применяется при исследовании таких важных аспектов медицины, как анализ Y-хромосомы и определение гаплотипов мтДНК. Идеального метода для SNP типирования нет, и выбор соответствующей методики определяется тем, что необходимо исследователю. Для судебной практики необходимо, например, чтобы метод позволял проводить высокоточную мультиплексную ПЦР при минимальных затратах.

2. Методики типирования ДНК

За прошедшие годы появилось множество различных методик типирования SNP, которые основаны на различных методах дискриминации аллелей. Чтобы понять каждую из технологий, необходимо разделять реакцию дискриминации аллелей и метод детекции. Продукты реакции дискриминации аллелей могут быть детектированы более чем одним методом и теми же методами может быть произведена детекция продуктов, полученных с помощью других реакций и образцов (табл. 1). Большинство методов генотипирования SNP могут быть сгруппированы в четыре группы, исходя из их молекулярного механизма действия: аллель-специфическая гибридизация (allele specific hybridization), достройка праймера (primer extension), лигирование олигонуклеотидных фрагментов (oligonucleotide ligation) и рестриктазный анализ. Существует несколько методов выявления продуктов и их анализа по каждой группе перечисленных выше реакций (флюоресценция, люминесценция и т. д.). Так же существуют две категории реакций в зависимости от их типа: гомогенные реакции, т.е. реакции в растворах и реакции, происходящие на твёрдой поверхности, как, например, адсорбция на поверхности стекла. Гомогенные реакции больше способствуют автоматизации процесса дискриминации аллелей, потому что не требуют после себя этапа сепарации и/или очистки. Однако основное препятствие – это ограниченная способность к мультиплексному анализу, тогда как реакции на твёрдых поверхностях имеют больше возможностей для мультиплексного анализа, хотя и требуют дополнительных манипуляций.

2.1. Аллель-специфическая гибридизация

Аллель-специфичная гибридизация, также известная как аллель-специфичная олигонуклеотидная гибридизация (ASO), основана на разделении двух ДНК-мишеней в одном локусе с помощью гибридизации. Конструируются два аллель-специфичных зонда, с полиморфным основанием в центре последовательности зонда. При оптимальных условиях реакции стабильные гибридизованные зонды образуются при условии полного соответствия оснований, а при несоответствии даже одной пары оснований зонд является нестабильным (рис. 1). ASO-зонды с обратной дот-блот последовательностью использовались для детекции первых полиморфизмов, анализировавшихся с помощью метода ПЦР в судебной медицине. Эти зонды до сих пор используются в ряде лабораторий, хотя сейчас всё больше вместо них используют метод STR-анализа. Чтобы получить преимущество при использования метода ASO-зондов при типировании SNP необходимо, чтобы использовались методы детекции, обеспечивающие высокую точность, чувствительность и производительность.

2.1.1. Гомогенная гибридизация с использованием системы переноса энергии с помощью флуоресцентного резонанса (FRET)

Перенос энергии с помощью флуоресцентного резонанса (FRET) происходит, когда два флуоресцентных красителя находятся очень близко друг к другу и спектр излучения одного перекрывает спектр возбуждения другого. Эти методы генотипирования объединяют и дискриминацию аллелей с использованием метода ASO-зондов с помощью ПЦР в реальном времени и количественный анализ. Поэтому в добавление к ASO-зондам требуется два праймера. Увеличить силу флуоресценции можно во время реал-тайм ПЦР или после её окончания. Существуют несколько вариантов, основанных на данном принципе.

2.1.1.1 Лайтциклер (LightCycler® Roche)

Этот метод основан на том, что, два специально синтезированных специфических олигонуклеотида метятся флуоресцентными красителями. Первый зонд несёт флуоресцентную метку на своём 3` конце, а второй зонд несёт другую метку (LC Red) на 5` конце. Последовательности двух олигонуклеотидов подбираются из расчёта полного их соответствия выбранному фрагменту ДНК. При гибридизации этих двух олигонуклеотидов два флуоресцентных красителя оказываются очень близко друг к другу. Один из них (флуоресцин) излучает зелёное свечение. Энергия, которая выделяется в результате, передаётся другому красителю (LC Red). Этот переход энергии, известный как FRET, является высоко зависимым от расстояния между двумя красителями. Энергия передаётся с высокой эффективностью только когда расстояние между двумя молекулами соответствует интервалу 1–5 нуклеотидов. Интенсивность свечения красителя LC Red определяется с помощью инструмента LightCycler®. Усиление флуоресценции пропорционально образованию ДНК при ПЦР. Измерение степени флуоресценции проводится сразу после того, как получен сигнал от красителя о гибридизации нуклеотидов. Один из зондов связан с полиморфным основанием в центре, другой же должен находиться рядом, чтобы произошёл перенос энергии. Хорошо известно, что ошибочное спаривание пары оснований вёдет к уменьшению температуры отжига олигонуклеотидов. И степень уменьшения напрямую зависит от того, какова длина олигонуклеотидного фрагмента, и места, где произошло неправильное спаривание. Для измерения изменений в температуре отжига строят кривую отжига. Таким образом, данный метод также можно использовать при гибридизации, выявляя мутантов и устанавливая ошибки спаривания оснований. Одновременно можно генотипировать более одного SNP, с использованием разных флуоресцентных меток на разных температурах отжига. Главное достоинство этого метода – это его чувствительность.

2.1.1.2 TaqMan® анализ (Applied Biosystems)

TaqMan® анализ основан на 5`-нуклеазной активности Taq-полимеразы, которая отщепляет нуклеотиды от олигонуклеотидных зондов, гибризованных с ДНК, вызывая флуоресцентный импульс. Необходимо два TaqMan® зонда с разными полиморфными сайтами. Один зонд должен быть комплементарен дикому аллелю, другой – полиморфному варианту. Эти зонды имеют разные флуоресцентные красители на 5`-конце и гасители флуоресценции на 3`. Когда зонды неактивны, то гасители взаимодействуют с красителем с помощью механизма FRET, блокируя флуоресцентную активность. На этапе отжига праймеров в процессе ПЦР TaqMan® зонды гибридизуются с молекулой ДНК. На этапе расплетения 5`-конец красителя отщепляется, благодаря 5`-нуклеазной активности Taq-полимеразы, что приводит к увеличению уровня флуоресценции красителя. Ошибочное спаривание оснований в зондах приводит к отщеплению целого зонда без высвобождения красителя. Генотип образца определяется отношением интенсивностей свечения двух разных красителей. Другой метод детекции, который может применяться с использованием 5`-нуклеазного анализа, называется флуоресцентной поляризацией.

2.1.1.2 Молекулярные маячки (molecular beacons)

Молекулярные маячки представляют собой олигонуклеотидные зонды, которые имеют два конца, фланкирующих комплементарный участок ДНК. На 5`-конце у них имеется флуоресцентный краситель, на 3`-конце – гаситель. Зонд, находясь в форме «шпильки», не гибридизуется, а краситель «тушится» с помощью гасителя и, таким образом, флуоресценции не происходит. Когда молекулярный маячок присоединяется к полностью комплементарному участку, краситель и гаситель оказываются далеко друг от друга, в результате возникает флуоресценция. Для типирования SNP используются два молекулярных маячка. Один специфичен для дикого аллеля, другой – для полиморфного варианта. Каждый из них маркирован разными красителями, которые позволяют дискриминировать аллели за один цикл ПЦР. Разные мишени могут быть детектированы в одной реакции. Это достигается использованием разным молекулярных маячков для каждой мишени и присоединением флуоресцентных красителей с разными спектрами флуоресценции. Число различных красителей, которые могут быть использованы в одной реакции, ограничено определяющей способностью современных аппаратов. Аппараты, использующие технологию ПЦР в реальном времени с одновременным флуоресцентным анализом, используют монохромный источник света, такой как лазер или диоды. С использованием меняющих длину волны молекулярных маячков данная проблема становится решённой. Эти зонды испускают флуоресцентное излучение в индивидуальном диапазоне, хотя возбуждаются одним монохромным источником. Этот подход увеличивает способность мультиплексного типирования SNP.

Принципиальное преимущество методов гомогенной гибридизации состоит в том, что они не требует пост-ПЦР процедур, т. к. ПЦР и детекция происходят в течение одной и той же реакции. Это позволяет определять SNP во множестве образцов и резко снижает вероятность контаминации.

2.1.2 Гибридизация на чипах и флуоресцентная детекция (array hybridization and fluorescence detection)

В этом подходе короткие олигонуклеотидные фрагменты прикрепляются к твёрдой поверхности, чтобы создать микромассив, и гибридизуются с флуоресцентно-меченными ПЦР продуктами, содержащими SNP. Это помогает анализировать множество SNP одновременно. Однако эффективность гибридизации зависит не только от полиморфных сайтов SNP, но и от их фланкирующих последовательностей. Таким образом, становится сложно подобрать оптимальные условия для одновременного анализа большого количества SNP. Эта трудность решается за счёт системы GeneChip® (Affymetrix) c использованием десятков ASO-зондов для каждого SNP. Зонды включают в себя все возможные варианты полиморфизмов. Этот метод разработан для типирования множества SNP, что необходимо для судебной медицины.

2.2 Удлинение праймеров (primer extension)

Удлинение праймеров основано на способности ДНК-полимеразы включать в синтезируемую цепь дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, комплементарные матрице. Существует несколько способов удлинения праймеров. Все они, однако, могут быть сгруппированы в две основные группы. К первой относятся процессы удлинения с помощью отдельных нуклеотидов (минисеквенирование), где полиморфное основание определяется за счёт включения ДНК-полимеразой дидезоксинуклеотидтрифосфата, комплементарного полиморфному основанию матрицы. Другая группа основана на аллель-специфичном удлинении, при котором ДНК-полимераза работает лишь в случае полного соответствия праймера последовательности цепи.

2.2.1.1 Метод электрофореза и флуоресцентной детекции: SNaP-shot (Applied Biosystems)

Одной из самых обычных коммерческих технологий, основанной на реакции минисеквенирования с последующим анализом методом электрофореза и флуоресцентной детекции является набор SNaP-shot фирмы Applied Biosystems. Для мультиплексного анализа в наборе используются флуоресцентные дидезоксинуклеотидтрифосфаты. Немеченый праймер находится на 3’-конце рядом с сайтом SNP. В праймере имеется ddNTP, меченый флуоресцентным красителем. Мультиплекс может быть получен путём пространственного разделения продуктов минисеквенирования при использовании «хвостов» разной длины на 5’-конце праймеров из набора SNaP-shot. Продукты можно выявить с помощью электрофореза.

2.2.1.2 Масс-спектрометрия (MALDI-TOF)

Для определения молекулярного веса продуктов с использованием минисеквенирования может быть использована технология матричной лазерной десорбции/ионизации с помощью масс-спектрометрии.

2.2.1.3 Микрочипы и флуоресцентная детекция

Микрочипы также удобны для генотипирования SNPs с помощью микросеквенирования. Они могут быть созданы на твёрдой поверхности или в растворе. В первом случае праймеры микросеквенирования присоединены к поверхности биочипа. Праймеры маркированы ddNTPs, а микромассив сканируется на предмет флуоресценции. Во втором случае генотипирование проводится с помощью отдельных оснований добавляемых к уникальному концу праймеров микросеквенирования. Продукт мультиплекса гибридизуется в растворе по принципу комплементарности.

2.2.1.4 Флуоресцентная поляризация

Как было описано ранее, ФП может быть использована для определения любых аллельных продуктов, которые имеют разные по сравнению с начальным продуктом массы. В случае микросеквенирования, праймер работает благодаря аллель-специфичному блокиратору красителя, увеличивая вес флуорофорного белка примерно в 10 раз.

2.2.2 Пиросеквенирование

Пиросеквенирование – это метод синтетического секвенирования. Эта технология использует систему белкового каскада, состоящую из 4 белков и специфических субстратов, которая генерирует излучение, когда нуклеотид комплементарен цепи ДНК. Этот сигнал детектируется, регистрируется в базе, и добавляется следующий нуклеотид. Детекция основана на пирофосфатном свойстве ДНК-полимеразы.

2.2.3 Аллель-специфичное присоединение

Аллель-специфическое присоединение основано на разнице в эффективности присоединения ДНК-полимеразой праймеров, связанного с совпадением и несовпадением 3’-конца. ДНК-полимераза присоединяет праймер только когда 3’-конец полностью комплементарен участку ДНК. Для каждого определения необходимо два праймера.

2.3 Аллель-специфическое лигирование олигонуклеотидов

ДНК лигаза является очень специфичным ферментом, который устраняет одноцепочечные разрывы в ДНК. Был описан метод лигирования одноцепочечных разрывов, как метод типирования SNP. Он основан на способности фермента ковалентно сшивать расположенные друг за другом нуклеотиды. Метод требует создания трёх зондов. Одного обычного и двух аллель-специфичных. Первый зонд отжигается сразу с SNP. Два других фланкируют 3’-области аллелей. Это создает одноцепочечный разрыв в структуре ДНК. Только аллельный зонд может слипнуться с основным.

2.4 Внесение разрыва

Анализатор Invader® (Third Wave Technology) основан на специфическом узнавании и разрезании, благодаря эндонуклеазной активности, трёхмерной структуры, образуемой в результате полной гибридизации олигонуклеотидов с ДНК. Необходимо наличие двух олигонуклеотидов, называемых «внутренний олигонуклеотид» и «зонд», которые отжигаются с ДНК неполностью. Внутренний нуклеотид комплементарен последовательности 3’-конца SNP. Зонд сделан с фрагментарным участком несущим аллельное основание. Таким образом, зонд имеет два региона, один из которых комплементарен одному из аллелей SNP и последовательности 5’-конца полиморфного сайта и некомплементарен последовательности 5’-плеча. Когда аллельное основание комплементарно основанию зонда, зонд неполностью спаривается с 3’-концом внутреннего олигонуклеотида, образуя структуру, которая узнаётся Flap эндонуклеазой и вырезается, освобождая 5’-конец зонда. Если произошла ошибка, то образованная структура не узнаётся ферментом и вырезания не происходит. Этот метод позволяет точно определять однонуклеотидные мутации.

3. Выводы

Технологии генотипирования SNP разрабатываются очень быстро, и, как результат, на сегодняшний день существует большое количество протоколов по генотипированию SNP. Необходимо учитывать множество факторов, прежде чем назвать лучший и наиболее полезный метод для судебной практики. Важным лимитирующим фактором всех методов можно признать необходимость большого количества материала для исследования каждого отдельного генотипа. Другим важным фактором является исследование растворов. Подчас бывает сложно тщательно исследовать структуру некоторых смесей с помощью маркёров, предлагаемых в методиках. На сегодняшний момент наиболее популярным методом считается минисеквенирование, особенно SNaPshot метод. Предполагается, что каждая из методик займёт своё место в лабораториях судебной медицины и станет возможным объединение и совместное использование разных методик при определении, например, Y-хромосомы. Также планируется создание базы данных по всем SNP.

 

Источник: Sobrino, B., M. Brion, and A. Carracedo, SNPs in forensic genetics: a review on SNP typing methodologies. Forensic Sci Int, 2005. 154(2-3): p. 181-94.

Перевод: Алексей Бурденный

 

Источник: Ген Эксперт